2017年3月6日

由:douano@www.291q.com

作者:伊莱亚斯博士，资深科学家

什么是内毒素?

内毒素(又称脂多糖，LPS或脂聚糖)是革兰氏阴性菌外膜的一部分，由脂质部分和多糖部分组成，多糖部分由内芯、外芯和o型抗原通过共价键连接而成¹．在动物体内，内毒素的脂质部分(称为脂质A)经常引起免疫细胞表面toll样受体4复体(TLR4/MD2/CD14)介导的强烈免疫反应²．这种免疫反应不受控制的激活通常与炎症介质的产生有关。这可能导致毛细血管渗漏综合征，导致血管内皮层损伤和扩张，心功能下降，体温升高(发烧);通常称为致命的败血性休克^1、2．

为什么内毒素污染在实验室很常见?

由于细菌广泛存在于自然界中，与植物和动物共存，内毒素无处不在。内毒素从死亡的细菌或作为正常细菌生命周期的一部分的囊泡/泡中自然释放^3.．的关键性质之一内毒素是其热稳定性高;它被发现是非常困难的停用/破坏使用正常的消毒条件。事实上，蒸汽杀菌在消灭活微生物的同时，无意中增加了玻璃器皿上的内毒素水平⁴．在生物化学上，内毒素本质上是疏水的，它们有粘附在其他疏水材料上的倾向，如普通的塑料实验室器皿。由于这些特性，内毒素污染在实验室程序中很常见。美国和欧洲药典指南规定，完全破坏内毒素需要在250℃干燥灭菌30分钟⁵．

FDA对内毒素浓度的限制是什么?

人类被发现对内毒素比其他动物更敏感。当每公斤体重的内毒素剂量为1µg时，人会引起感染性休克，而小鼠可以耐受1000倍以上的内毒素剂量。由于细菌内毒素是最常见的热原性污染物，美国食品和药物管理局(FDA)对人类和兽医非肠道药物和医疗设备的内毒素浓度设置了限制。内毒素水平用EU/ml来衡量，其中EU代表内毒素单位。一个EU约等于0.1至0.2 ng内毒素/毫升溶液，取决于所使用的参考标准;这是10⁵到10¹⁰细菌。FDA指南规定内毒素单位，而不是重量应用于测试比较，因为内毒素引起热原效应的效力取决于多种因素:多糖链长度，聚集，在生物液体中的溶解度，细菌来源，相关物质等。目前美国药典对肠外给药的内毒素限制为每小时5 EU/kg体重，鞘内给药的内毒素限制为0.2 EU/kg。医疗器械内毒素限值为0.5 EU/ml或20 EU/器械，脑脊液接触器械内毒素限值为0.06 EU/ml或2.15 EU/器械伟德亚洲游戏室^{6 - 9}．

什么是兔子热原测试?

在20世纪40年代引入的兔热原试验，在筛选用于验证肠外药物的水和溶液方面非常成功。然而，这种测试是昂贵的，耗时的，并不是很定量。20世纪70年代体外通过对马蹄蟹(鲎波吕斐摩斯)在内毒素水平很低的情况下，阿米巴细胞裂解液会凝结。这被称为鲎试剂或LAL试验。LAL测定法在20世纪70年代被FDA批准用于测量与血液接触的肠外药物、设备和产品中的LPS伟德亚洲游戏室⁸．LAL试验至少有三种形式，每一种都有不同的敏感性:1)LAL凝胶凝块试验，2)LAL动力学浊度法，3)LAL显色法。前者内毒素含量可达0.03 EU/ml，后两者内毒素含量可达0.01 EU/ml^7、8．

什么是低内毒素/脂多糖回收率(LER/LLR)?

尽管LAL是一种在极低水平下检测内毒素存在的强有力的测定方法，但在最近的过去，尽管USP热原试验中样品可能保持热原性，但当发现产品或加工材料中可测量的内毒素浓度随着时间的推移(如在储存期间)而下降时，人们的担忧有所增加。这种现象被称为内毒素/脂多糖低回收率或LER/LLR。研究表明，LER/LLR现象可能是由于内毒素被广泛使用的聚山梨酯和柠檬酸盐等药物辅料或添加/污染的蛋白质所掩盖而发生的^8、10、11．

由于LER已经在一系列不同的样本矩阵中被观察到，所以还没有解释LER的具体机制;尽管已经提出了许多假设。Chen和Vinther认为，螯合剂和聚山酸酯可能会掩盖内毒素，并形成LER/LLR复合物，抑制内毒素与LAL反应所需的受体因子C结合¹²．然而，其他研究结果并不支持任何具体的机制。在一项研究中，在低浓度的表面活性剂(0.0001% v/v聚山梨酯20)下，LAL活性增强到约180%。随着表面活性剂浓度的增加，LAL活性下降，在0.0025% v/v聚山梨酯20左右时，LAL活性几乎为零。其他研究表明，内毒素与制剂在聚集、溶解和掩蔽方面存在相互作用。据报道，时间和温度也对LER有影响。据报道，LER现象在室温下比在2-8℃下发生得更快，7天的孵育足以确定药物是否具有LER。当有机化合物如柠檬酸盐、醋酸盐和MES缓冲液包括苯甲脒(蛋白酶抑制剂)或EDTA或二甲基亚砜作为辅料存在于产品中时，LER也有报道^{12日,13日,17岁}．

目前FDA的建议和指南是什么内毒素/脂多糖回收率低?

随着大量研究表明药物配方中的LER/LLR现象越来越明显，FDA开始关注药物和医疗器械中的LER/LLR，并提出了新的USP指南，尽管旧的指南仍然存在。USP指南建议药品生产商对所有新药进行保持时间研究，以检测LER/LLR。保存时间研究应通过在未稀释的产品中加入已知的内毒素量，然后在适当的储存条件下测量可检测内毒素的浓度¹³．内毒素浓度下降是LER的提示。除了保存时间研究，USP还提出了一个新的参考标准(RS)，从革兰氏阴性菌中提取的天然内毒素(NOE)。USP科学部的首席科学联络人Radhakrishna S. Tirumalai博士在最近的一篇评论中详细描述了使用NOE作为RS的原因¹⁴．未来使用NOE进行LPS定量的原因是非常深思熟虑的:首先，天然内毒素是革兰氏阴性菌外膜的囊泡或“气泡”。其次，由自然死亡的细菌产生的细胞壁碎片是现实生活中的污染物，它们可能存在于制药原料、水系统、工艺样品和最终药品中。第三，化学提取的LPS通常被称为“内毒素”，它在自然界中不存在，在生物化学上与天然内毒素不同。第四，提取的LPS从细胞壁剥离，被吸收到表面，并在溶液中形成胶束和其他聚集体。第五，不同的产品配方和温度、pH值、盐、洗涤剂、螯合剂等因素也对聚合有影响。显然，提取的LPS作为RS可能是不合适的选择，因为它在化学上、生物学上和结构上都不同于天然的革兰氏阴性菌细胞壁碎片。新的USP指南还包括对菌株的建议，以及模拟“真实世界”内毒素污染的“NOE”的制备、存储和记录方法¹⁴．

克服低内毒素/低脂多糖回收率的策略是什么?

许多克服LER/LLR的策略已经被提出。样品稀释至1/1000后，内毒素测定中添加内毒素的回收率显著提高，可克服LER/LLR¹⁵．在两种用聚山梨酯80、柠檬酸盐或磷酸钠配制的抗体中加入硫酸镁，内毒素分析显示可以减轻LER/LLR^15日16．在一项研究中，据报道，冻融制度可以减轻LER/LLR。其他研究表明，用蛋白酶处理内毒素可以减轻内毒素检测中的LER^16，17．考虑到与不同产品和辅料的不同相互作用，可以想象，一种特定的策略不会适用于所有产品，需要为每种产品制定策略^{16日至18日}．

结论:

由于内毒素丰富、热稳定性高且难以清除，建议采用两种一般策略来解决和缓解LER/LLR现象。第一个策略是将内毒素污染降到最低，即在进入产品的材料中，在其制造的所有过程中，预防生产过程中的生物负担，并确保在相关工艺步骤中去除内毒素。其次，制定检测LER的策略，并制定克服LER/LLR的方法。

列出实验室是高质量内毒素的主要制造商之一。我们的脂多糖(LPS)及其衍生品(产品# 400，# 401，# 421，# 423，# 433，# 434)采用专利技术从各种细菌来源中提纯。GMP级内毒素可按客户要求订购。这些内毒素广泛应用于免疫生物学领域，在各种细胞培养工作中作为免疫刺激物/调节剂和佐剂。在细胞培养研究中，无内毒素培养基和试剂被认为是一种常规做法，因为内毒素已被证明会影响/干扰细胞生长和功能，并被认为是显著可变性的来源。我们的每一个毒素产品都由我们的QC部门使用FDA批准的LAL检测试剂盒和FDA批准的LAL检测方法仔细检测内毒素水平。内毒素含量的详细情况在产品的分析证明中有提及。

1. Rietschel, e.t.，Kirikae, T.， Schade, F.U.， Mamat, U.， Schmidt, G.， Loppnow, H.， Ulmer, a.j.， Zähringer, U.， Seydel, U.， Di Padova, F。细菌内毒素:结构与活性和功能的分子关系。中国医学工程学报，1994,12(2):381 - 381。PMID:8119492.
2. 大藤，U，深濑，K，三宅，K，清水，T。结构基础先天免疫受体TLR4/MD-2对物种特异性内毒素的感知。《。学会科学。中国生物医学工程学报，2012,29(6):769 - 769。PMID:22532668．
3. 库尔普(Kulp)，库恩(Kuehn)， M.J.生物功能以及细菌分泌的外膜囊泡的生物发生。为基础。微生物学报，2010,64:163-84。PMID:20825345．
4. 海克尔，W .，维特霍尔，D.，斯塔克，A。干热灭活细菌内毒素的验证。PDA J制药公司。科学。材料科学与技术，1994,7- 8;48(4):197-204。PMID:7804819．
5. 醒来时,T。破坏用LAL法和热原法测定了典型内毒素的含量。我父母。科学。技术，1993,9 - 10;47(5):258-64。PMID:8263663．
6. Gorbet, m.b.，Sefton, M.V.内毒素:不速之客。2005年12月,26(34):6811 - 7。PMID:16019062.
7. Iwanaga, S。生化原则鲎试剂检测细菌内毒素．Proc日本。B爵士物理生物学。科学通报，2007;83(4):110-9。PMID:24019589．
8. 陈杰，安德斯六世。常见生物制品内毒素回收率低。非肠外药物协会年会，奥兰多，佛罗里达州，2013年4月。
9. 美国食品和药物管理局。工业指南:热原和内毒素检测:问题和回答。2012年6月。
10. 博登，j.s.，沃伯顿，r.e.，费兰，R.，墨菲，M.，史密斯，K.R.，德·费利皮斯，m.r.，陈，D.。内毒素用鲎试剂(LAL)进行回收。2016年9月,44(5):434 - 40。PMID:27470947．
11. 凯伦Z.M.目前USP对低内毒素回收率(LER)的看法。内毒素检测第四部分。《美国药学评论》增刊，2016。Recovery-LER /。
12. 陈，J，和Vinther, A。常见生物制品内毒素回收率低(LER)。奥兰多:肠外药物协会年会;2013.
13. Karen, Z.， Radhakrishna, T.， David, H.， James, A.， Dennis, G.， Robert, M.，和Donald, S.。内毒素标准及其在康复研究中的作用:前进的道路。亚洲生物制药。2016年11月/ 12月。
14. 拉达克里希纳，s.t。天然内毒素:美国药典提出的一种新的参考物质。美国药学评论。内毒素补充2016。
15. Burgenson, A.L.来自不同来源的内毒素:反应性和可恢复性的可变性。在药物微生物学论坛上发表。细菌内毒素高峰会议，费城，宾夕法尼亚州。2014.
16. Platco C。实验室经验:内毒素回收率低。在药物微生物学论坛上发表。细菌内毒素高峰会议，费城，宾夕法尼亚州。2014.
17. 威廉姆斯,K.L.内毒素聚集和结合特性。从产品和容器中回收内毒素尖刺。2014年在德国柏林非肠外药物协会会议上的演讲。
18. 蒂姆,S。制药过程中蛋白质内毒素的去除。内毒素检测第四部分《美国药学评论》增刊2016。